蜡状芽胞杆菌类群（Bacillus cereus group）分类研究
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序言
我有一个梦想：希望全世界都能明晰蜡状芽胞杆菌类群（Bacillus cereus group）分类。基于此，我发表了《Genomic insights into the taxonomic status of the Bacillus cereus group》文章[1]。虽然文章已发表两年，google scholar引用已过40，但是，一些同仁的困惑和近两年文献的检索使我意识到：我的梦想依旧是镜花水月。每每掩卷深思，我总觉得应该为梦想做点什么；又适逢《微生物生态》公众号主编卢瑟菌诚挚邀稿，故聚各方因缘而终促成此文。先附拙文链接（https://www.nature.com/articles/srep14082），也算“刘公卖瓜，自卖自夸”，欢迎各位看官“拍砖”。闲言碎语不多讲，咱言归正传。
1. 前言
蜡状芽胞杆菌类群（Bacillus cereus group）在自然界广泛分布，并且与工农业生产密切相关，但也时刻威胁着人畜健康。比如：炭疽芽胞杆菌毒力质粒产生的炭疽毒素对人畜有极高的致死率；蜡样芽胞杆菌产生的毒素常引起恶心呕吐或腹痛腹泻等；苏云金芽胞杆菌产生的伴胞晶体（即cry蛋白）因能够杀死许多昆虫而被作为生物杀虫剂[2]。尽管B. cereus group很重要，但是，不管是生理生化实验，还是单/多基因PCR扩增，甚至是毒力质粒特征等，都不能很好地区分B. cereus group。这给B. cereus group深入研究带来了许多困难和挑战。
蜡状芽胞杆菌类群目前包括11个模式种（图1A），即炭疽芽胞杆菌（B. anthracis），蜡样芽胞杆菌（B. cereus），蕈状芽胞杆菌（B. mycoides），假蕈状芽胞杆菌（B. pseudomycoides），苏云金芽胞杆菌（B. thuringiensis），韦氏芽胞杆菌（B. weihenstephanensisare），大山芽胞杆菌（"B. gaemokensis"），万里浦芽胞杆菌（"B. manliponensis"），细胞毒素芽胞杆菌（B. cytotoxicus），东洋芽胞杆菌（B. toyonensis）和兵马俑芽胞杆菌（"B. bingmayongensis"）；而其模式菌株间16S rRNA基因序列相似度远高于97%（图1B）。【作者注：加引号的拉丁名，表示该命名有效但未合法出版】
图1. B. cereus group模式菌株及其16S rRNA基因相似度
那么如何区分这些高度近缘的B. cereus group菌株呢？近些年，迅猛发展的基因组测序被寄予厚望。同时，NCBI中B. cereus group数百株基因组序列为其分类研究提供了良好的材料。因此，我们与德国DSMZ的Markus Göker等合作，利用基因组序列，对B. cereus group进行了系统的研究。
2. 研究方法
根据224株B. cereus group的基因组数据，分别从：①基于GGDC在线工具（http://ggdc.dsmz.de/）的数字DNA-DNA杂交值（dDDH）、②16S rRNA基因序列、③串联看家基因的多位点基因序列分析（MLSA）和④毒力质粒分析等四个层面，详细研究了B. cereus group的分类。
3. 研究结果
3.1 基于dDDH分析B. cereus group
224株B. cereus group菌株间的dDDH计算是与德国DSMZ的Markus Göker等合作完成。基于70%DDH细菌种定义的“金标准”[3]，我们对所有dDDH进行了聚类。结果表明：224株B. cereus group菌株可划分为30个类群，共代表30个种，其中包括10个已确定的物种（B. weihenstephanensis实际归属于B. mycoides）和20个潜在的新种（图2）。基于dDDH分析结果，我们发现：224株菌中，仅有75株菌的鉴定或者命名是正确的。
图2. B. cereus group基于dDDH的聚类树
3.2 基于16S rRNA 基因分析B. cereus group
通过本地Blast从224株菌中共获得1407条16S rRNA基因序列，这表明此类群的16S rRNA基因是多拷贝，且拷贝数较高。同时，不同菌株间的16S rRNA基因的拷贝数也不尽相同（1~19个）。基于dDDH结果，16S rRNA基因的种间相似度为97.3-100%，种内为99.0-100%，甚至是同一株菌的相似度（99.1-100%）也有较大差异（图3）。因此，16S rRNA基因并不能很好区分B. cereus group。
图3. B. cereus group菌株16S rRNA基因相似度范围
3.3 基于MLSA分析B. cereus group
MLSA共串联了20个看家基因。与上述dDDH分析相同，B. cereus group菌株可划分为30个簇，对应于dDDH分析中的30个种（图2）。同时，dDDH和MLSA相关性分析表明：97.5%的MLSA可作为种间阈值（图4）。另外，看家基因pycA和ccpA（如果需要）可对B. cereus group进行快速和较精确的分类。
图4. B. cereus group的dDDH和MLSA相关性分析
3.4 基于毒力质粒分析B. cereus group
以pXO1和pXO2质粒上的毒力基因（pXO1：cya、lef、pagA；pXO2：capA、capB、capC、capD、capE）和复制起始蛋白编码基因（repX和repS）及cry基因作为参照序列来表征毒力质粒的分布。如图2所示，pXO1主要存在于B. anthracis，而pXO1-like分布较广泛；pXO2存在于5个种，而pXO2-like分布更广。同时，cry基因在B. thuringiensis及其他10个种中均有分布。因此，毒力质粒不能作为B. cereus group菌株分类和鉴定的依据。
4. 研究结论
（1）基于dDDH和MLSA分析，B. cereus group共包括30种，即10个已鉴定的种和20个潜在新种。
（2）多拷贝和异质性的16S rRNA基因不适用于B. cereus group的准确分类，而pycA和ccpA基因可对其进行快速和较精确分类。
（3）毒力质粒不能用作B. cereus group菌株分类依据。
参考文献
[1] Liu Y, Lai Q, Göker M, et al. Genomic insights into the taxonomicstatus of the Bacillus cereus group[J]. Scientific Reports, 2015, 5.
[2] Rasko D A, Altherr M R, Han C S, et al. Genomics of the Bacillus cereus group of organisms[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29(2):303-329.
[3] Wayne L G, Brenner D J, Colwell R R, et al. Report of the ad hoccommittee on reconciliation of approaches to bacterial systematics[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 1987, 37(4):463-464.
后记
如果各位对B. cereus group感兴趣，随后我将和大家分享B. cereus group最新研究。同时，我也希望能有更多机会与大家交流，专业不限，话题不限。另外，如对此文或此人（偶尔自恋）感兴趣，可QQ（504851347）或邮件（liuhaolin3@163.com）联系。再次感谢各位读者和卢瑟菌的邀请，我对诸位的感激之情犹如滔滔江水….哗啦啦啦啦啦啦啦啦….
作者简介
编辑评语：
刘阳博士的工作意义不仅在于理清了蜡状芽胞杆菌类群的分类，更为我们分析近缘物种的分类提供了可借鉴的思路。
特别感谢：
国家海洋局第三海洋研究所博士生，黄兆斌，对本文的耐心校稿。
卢瑟菌